本发明涉及式(C)或式(D)的标记试剂,其中R
1.式(C)的标记试剂:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="574"/>其中:·R₁表示可检测标记物或通过至少一个多聚体结构连接在一起的至少两个可检测标记物,其中所述可检测标记物选自生物素、半抗原、荧光体、荧光基团和发光基团,·R₂和R₃彼此独立地表示:H、NO₂、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR²、R、NHCOR、CONHR、COOR,其中R=包含1-6个碳原子的饱和脂族烃基或单环芳族基团,·L是连接臂,其包含具有至少两个共价键的直链并且包含重复1-20次的-(O-CH₂-CH₂)-基团,并且·重氮甲基官能团在吡啶环的氮原子位置的对位上。
2.式(D)的标记试剂:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="386"/>其中:·R₁表示可检测标记物或通过至少一个多聚体结构连接在一起的至少两个可检测标记物,其中所述可检测标记物选自生物素、半抗原、荧光体、荧光基团和发光基团,·R₂表示:H、NO₂、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR²、R、NHCOR、CONHR、COOR,其中R=包含1-6个碳原子的饱和脂族烃基或单环芳族基团,·R₄表示:H、包含1-6个碳原子的饱和脂族烃基或单环芳族基团,·L是连接臂,其包含具有至少两个共价键的直链并且包含重复1-20次的-(O-CH₂-CH₂)-基团,并且·重氮甲基官能团在吡啶环的氮原子位置的对位上。
3.具有式(E)的标记试剂:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中:·R₂和R₃彼此独立地表示:H、NO₂、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR²、R、NHCOR、CONHR、COOR,其中R=包含1-6个碳原子的饱和脂族烃基或单环芳族基团,并且·n是1-12的整数。
4.权利要求3的标记试剂,其中n是1-6的整数。
5.权利要求2的标记试剂,其具有式(F):ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中:·R₂表示:H、NO₂、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR²、R、NHCOR、CONHR、COOR,其中R=包含1-6个碳原子的饱和脂族烃基或单环芳族基团,·R₄表示:H、包含1-6个碳原子的饱和脂族烃基或单环芳族基团,·-Y-X表示-CH₂NH-、–CONH-、-NHCO-、-CH₂O-或-CH₂S-,并且·m、n和p彼此独立地各自是1-12的整数。
6.权利要求5的标记试剂,其中m、n和p彼此独立地各自是1-6的整数。
7.权利要求3和4中任一项的标记试剂,其具有式(G):ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>
8.权利要求2、5和6中任一项的标记试剂,其具有式(H):ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>
9.权利要求1-2中任一项的试剂,其特征在于R₁由式(I)的D-生物素残基构成:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="558"/>
10.用于合成权利要求1、3、4和7中任一项的标记试剂的方法,其包括以下步骤:a)使芳族羧酸衍生物与内酯的烯醇化物进行Claisen型反应以形成环状前体,b)然后用卤代酸使所述环状前体开环以形成芳族卤代酮,c)通过保护基保护所述芳族卤代酮的羰基官能团以形成受保护的前体,d)使所述受保护的前体进行Gabriel型胺化反应以形成胺化了的前体,e)将所述胺化了的前体脱保护以释放胺官能团,使所述胺官能团与其羧基官能团被活化的可检测标记物反应以形成包含可检测标记物的前体,f)使经标记的前体进行所述羰基官能团的脱保护反应以形成经标记的且包含羰基的前体,并且最终g)通过将所述羰基官能团转化为重氮官能团,将所述经标记的且包含羰基的前体转化为如上所述的标记试剂。
11.用于合成权利要求2、5、6和8中任一项的标记试剂的方法,其包括以下步骤:a)将芳族二羧酸酯化以形成二酯,b)用衍生自单保护的胺化了的乙二醇的化合物区域选择性地取代所述二酯以形成羰基官能团和胺官能团受保护的前体,c)然后将所述前体还原为醇并且氧化为醛,d)将在步骤c)中合成的醛进行酸处理以便在将所述胺官能团脱保护时伴随地保护该官能团以得到胺化了的缩醛,e)使所述胺化了的缩醛与其羧基官能团被活化的可检测标记物反应以形成包含可检测标记物的前体,f)使经标记的前体进行所述羰基官能团的脱保护反应以形成经标记的且包含羰基的前体,并且最终g)通过利用Bamfordxa0Stevens型反应将所述羰基官能团转化为重氮官能团,将所述经标记的且包含羰基的前体转化为如上所述的标记试剂。
12.用于标记生物分子的方法,其包括在基本为水性的缓冲液形式的均质溶液中使生物分子和权利要求1-9中任一项的试剂接触。
13.权利要求12的方法,其中所述生物分子为核酸。
14.用于标记和断裂单链或双链核酸的方法,其包括以下步骤:·将所述核酸断裂,·通过选自权利要求1-9中任一项的试剂的标记试剂将标记物结合在至少一个片段上,所述试剂共价地且主要地偶联在所述片段的至少一个磷酸上。
15.权利要求14的方法,其特征在于在两个步骤中完成所述断裂和所述标记。
16.权利要求14的方法,其特征在于在一个步骤中完成所述断裂和所述标记。
17.权利要求14-16中任一项的方法,其特征在于在基本为水性的均质溶液中完成所述标记。
18.权利要求14-16中任一项的方法,其特征在于通过酶、物理或化学途径完成所述断裂。技术领域
本发明涉及用于标记生物分子的新型试剂,用于合成所述标记物方法以及特别是在使用核酸的检测和分析的分子诊断领域中用于标记生物分子的应用。xa0
背景技术
现有技术表明存在许多用于标记核苷酸、寡核苷酸、天然核酸或经扩增的核酸的方法。xa0一种方法在于将标记物与碱基结合,不管后者是天然的还是经改性的。另一种方法提出将标记物与糖结合,在此仍然不管其是天然的还是经改性的。再一种方法的目的是将标记物与磷酸(phosphate)结合。xa0在碱基上进行标记已被特别地用于通过插入被直接标记的核苷酸来标记核酸的方法中。xa0在糖上进行标记常用在通过化学合成制备的核酸探针的情况中。xa0在磷酸上进行标记也已被用于在寡核苷酸的化学合成过程中引入官能化的臂和标记物。xa0实际上,需要进行核苷酸或核苷酸类似物或核酸标记的本领域技术人员倾向于在碱基或在糖上进行该结合,这给予他们更多的便利和更多的选择。此外,这也是从许多文献的研究中显现出来的,如关于碱基的EP-A-0.329.198、EP-A-0.302.175、EP-A-0.097.373、EP-A-0.063.879、US-A-5,449,767、US-A-5,328,824、WO-A-93/16094、DE-A-3.910.151、EP-A-0.567.841或关于糖的EP-A-0.286.898。xa0标记物在磷酸上结合是比将碱基或糖官能化的技术更复杂的技术,并且,由于磷酸的低反应性而特别少地被使用(参见如Jencksxa0W.P.等人,J.Amer.Chem.Soc.,82,1778-1785,1960)。相似地,在涉及将探针引入寡核苷酸片xa0段的方法的O’Donnel和Mcxa0Laughlin的综述(“Reporterxa0groupsxa0forxa0thexa0analysisxa0ofxa0nucleicxa0acidxa0structure”,pxa0216-243,于“Bioorganicxa0Chemistry:Nucleicxa0Acids”,Ed.Hechtxa0S.M.,Oxfordxa0Universityxa0Press,1996)中,核苷酸间磷酸二酯的有效烷基化被认为是不可能的。xa0专利申请WO-A-99/65926描述了用于标记合成或天然的核糖核酸(RNA)的方法,其将RNA断裂并且在末端磷酸上进行标记。该文献描述了可用于标记和断裂的一些官能团,如羟基、胺、肼、烷氧基胺、卤代烷和苄型卤代烷官能团,特别是衍生物5-(溴甲基)荧光素。这些官能团使对核酸进行标记成为可能,但是由于这样的标记发生在断裂过程中释出的磷酸上,所以需要包括断裂步骤以进行有效的标记。此外,需要加入相对于RNA显著过量的标记试剂以得到有效的标记,这在检测过程中产生由过量的标记物造成的背景噪声问题。最终,该方法不能有效地用于双链DNA。xa0因此,人们需要新型试剂,其在标记结果方面是有效的,在标记位置方面是特异性的,并且特别地,其不影响通过氢键参与双螺旋形成的碱基的杂交性质,所述的新型试剂可用于DNA和RNA,最后,其能对核苷酸、寡核苷酸、天然核酸或通过转录、逆转录或通过酶扩增制备的那些核酸进行非选择性标记。xa0本申请人已提出了符合上述条件的新型标记物,其使用重氮甲基官能团作为用于标记的反应性官能团。例如专利申请WO-A-02/090319、WO-A-02/090584和WO-A-2005/092910中情况就是这样。xa0因此,重氮甲基官能团(结构式-C(N₂)-)已被用于磷酸基团的烷基化,但却产生了一些问题。一方面,包含至少一个重氮官能团的试剂通常本身是不稳定的,这在将这些试剂用于标记试剂盒时产生问题,如果经标记的产物的官能团要显示一些样品中存在目标生物分子,这就是不利之处。xa0最后,为确保稳定性,将由苯基型的芳环产生的具有重氮甲基官能团的试剂与某些标记物如生物素结合。所述芳环的存在和所述标记物的性质使得这些试剂在水中的溶解度差,这导致使用与水混溶的有机溶剂进行与仅溶于水或水性缓冲液的生物分子的偶联。但是如果以过高的浓度将这些溶剂用于标记反应,则它们可能造成所述生物分子沉淀。此外,为了集成设备中标记规程的自动化,必需将所述标记试剂在不含有机溶剂的缓冲液xa0中冷冻干燥。后者不适于冷冻干燥。因此,需要能够获得在水性介质中充分可溶且稳定的标记试剂。xa0由前述文献WO-A-02/090319、WO-A-02/090584(第一代分子)和WO-A-2005/092910(第二代分子)提出的标记试剂也解决了这些技术问题。xa0因此,这些分子存在以下的缺陷:xa0-化学上不稳定,因为它们必须是干燥的、或处于4°C的溶液中,xa0-合成相对复杂,并且xa0-在水溶液中溶解性差。xa0尽管存在这些缺点,这些分子对于本领域技术人员仍然是特别感兴趣和吸引人的。不管怎样,在公开于文献WO-A-2009/001017中的第三代分子研发过程中,改善它们的物理或化学特性是重点,所述第三代分子中的分子稳定且易于合成。xa0这一方案的启动可解决第一代和第二代分子稳定性的问题,但它们的溶解度比第二代分子略差(在100%水中为0.3mM)。虽然如此,本申请人在此继续沿着该路线并公开新型分子,该新型分子比第三代分子的溶解度大得多(在100%水中的溶解度为2-28mM),并具有与我们之前的发明中已描述的分子相同或与之相比更佳的稳定性。xa0以上公开的四篇文献给出了前三代分子,它们都是基于存在与环相邻的重氮甲基官能团。对公开本发明的正文中由于非刻意忽略而缺少的任何补充性解释,请读者参考这四篇文献xa0为此,本新发明提出在重氮甲基官能团α位引入吡啶环,识别基团在α’位或在吡啶环上(参见图2,分子10或分子19)。第四代分子提供兼有稳定性和溶解性的最佳性质。xa0这给予所述分子:xa01)在4°C以干燥形式或在室温以溶液形式的情况下,化学稳定性大于或等于硝基DKB。该特性来自吡啶环的吸电子作用,与第三代分子的硝基芳基相同,其显著地稳定重氮官能团。xa02)吡啶环上存在的氮原子导致显著更大的溶解度。xa03)比用于标记核酸的商业方法更好的与核酸的反应性。xa0本发明是对现有分子的重大改进。实际上第一和第二代分子存在化学上不稳定的缺陷,尽管与以前存在的分子相比已在这方面有所改进。因为在+4°C储存一年之后所得结果非常良好,所以所述标记仍然非常有效。此外,它们的合成仍然相对复杂。第三代分子稳定得多且更易于合成,这在包含这些分子的试剂盒的有效期和合成的工业化程度方面提供了相当大的优势。xa0如果在低温下储存在无水有机溶剂中,第一代和第二代分子功能稳定持续一年。第三代分子无论在液体介质中或以干燥形式都在功能和化学上稳定得多。因此,在已干燥(如干燥或冷冻干燥)储存之后,它们可在水性介质中使用显著更长的时间(10至100倍长),对于在冷冻干燥储存过程中不稳定的第一代或第二代分子,情况就不是这样了。xa0该第三代分子的工业化升级在集成设备或微系统中特别重要,在集成设备或微系统中所采用的化学必需非常有效和稳健,而不会在出现问题时不利地影响某些试剂的稳定性。xa0最后,所述第一代和第二代分子在水溶液中的溶解性差,这对于必须在开始反应前将这些分子适当溶解的使用者造成不便。xa0但是,即使这些分子和标记方法是有效的,通过第三代新型分子和进一步提高标记功效的标记此类分子的新方法,本申请人成功地找到了解决第一代和第二代分子稳定性问题的方案。xa0但是,无论是这三代分子中的哪一种分子,另一问题在于它们缺乏溶解性。因此,已将两种新的分子官能团组合以创造这些新型试剂。将它们定义如下:xa0·重氮甲基官能团在α位上具有吡啶环,其本身可被一个或多个基团在间位、对位或邻位单取代或多取代。xa0·所述重氮官能团:xa0-如在第三代分子中,在α’位上可具有允许检测的基团;该基团可以是生物素或任何其它的可检测的基团。xa0-可以不具有可检测的基团,在该情况中,如在第一代和第二代分子中,其由环即吡啶环产生。xa0应注意的是,第四代分子与第三代分子同样地稳定和具有反应性,但是由于吡啶环的存在,它们的溶解性得以改进,所述吡啶环同样因其吸电子作用使重氮甲基官能团稳定。xa0在专利申请WO-A-2005/092910中给出了“多聚体结构”、“可检测标记物”、“间接系统”、“荧光体”及其它感兴趣的标记物、“缀合”、“生物分子”、“核酸”、“酶扩增反应”、“基本为水性的溶液”、“均质溶液”、“固体载体”和“纯化步骤”的定义,并且请读者在需要的情况下参考该文献。xa0同样地,在前述的专利申请中还描述了:xa0·接枝化学和xa0·在核酸的3’或5’端引入磷酸的技术,并且读者可在该文献中找到完全理解本发明所需的所有信息。xa0此外,与在第一代和第二代分子中一样,这些第三代分子具有的重氮甲基官能团能将核酸共价接枝于载体上。特别是与吸附相比,所述接枝简单,而且键稳定,并能实现核酸在固体载体上的偶联,这样通过减小空间位阻便利所有后续的杂交步骤。xa0这一被描述为第四代的新型分子家族被称为吡啶重氮酮生物素(PyDKB)或吡啶重氮生物素(PyDB),并且分别由对应PyDKB的式(C)和对应PyDB的式(D)的相对温度稳定的标记试剂表示(参见以下)。xa0
发明内容
根据第一个实施方案,本发明提供式(C)的标记试剂:xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="561"/>其中:xa0·R₁表示可检测标记物或通过至少一个多聚体结构连接在一起的至少两个可检测标记物,xa0·R₂和R₃彼此独立地表示:H、NO₂、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR²、R、NHCOR、CONHR、COOR,其中R=烷基或芳基,并且xa0·L是连接臂,其包含具有至少两个共价键的直链。xa0根据第二个实施方案,本发明提供式(D)的标记试剂:xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="366"/>其中:xa0·R₁表示可检测标记物或通过至少一个多聚体结构连接在一起的至少两个可检测标记物,xa0·R₂表示:H、NO₂、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR²、R、NHCOR、CONHR、COOR,其中R=烷基或芳基,xa0·R₄表示:H、烷基或芳基,并且xa0·L是连接臂,其包含具有至少两个共价键的直链。xa0同时具有标记物R₁和所述重氮甲基官能团(式C)的臂的位置在吡啶环的氮原子位置的对位、间位或邻位上。优选地,该臂在所述吡啶环的氮原子位置的对位上。xa0具有标记物R₁的臂的位置或具有重氮甲基官能团(式D)的臂的位置彼此独立地在所述吡啶环的氮原子位置的对位、间位或邻位上。优选地,具有所述重氮甲基官能团的臂在所述吡啶环的氮原子的对位上,而具有所述标记物R₁的臂在所述吡啶环的所述氮原子的邻位上xa0优选地,R₂和/或R₃在重氮官能团的间位。该位置使得所述重氮甲基官能团与取代基R₂和/或R₃缀合。xa0从本发明的意义上说,烷基应被理解为指:包含1-6个碳原子(有利地是1-2个、1-3个或1-4个碳原子)的饱和脂族烃基,其是直链或当烷基链包含至少3个碳原子时是支链的或环状的。例如:可以提及甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、甲基环丙基、戊基、2’2-二甲基丙基、己基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基。xa0从本发明的意义上说,芳基应被理解为指单环芳族基团,如苯基。xa0根据所述第一个实施方案的第一项修改,本发明提供标记试剂,其具有式(E):xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中:xa0·R₂和R₃彼此独立地表示:H、NO₂、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR²、R、NHCOR、CONHR、COOR,其中R=烷基或芳基,并且xa0·n是1-12的整数,优选1-6的整数。xa0根据所述第二个实施方案的第一项修改,本发明提供标记试剂,其具有式(F):xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中:xa0·R₂表示:H、NO₂、Cl、Br、F、I、OR、SR、NR²、R、NHCOR、CONHR、COOR,其中R=烷基或芳基,xa0·R₄表示:H、烷基或芳基,xa0·-Y-X-表示-CH₂NH-、-CONH-、-NHCO-、-CH₂O-或-CH₂S-,并且xa0·m、n和p彼此独立地各自是1-12的整数,优选1-6的整数。xa0根据所述第一个实施方案的第二项修改,本发明提供标记试剂,其具有式(G):xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>根据所述第二个实施方案的第二项修改,本发明提供标记试剂,其具有式(H):xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>无论哪个所述实施方案或其修改,以上所公开的本发明的试剂优选包含由式(I)的D-生物素残基构成的基团R₁:xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="544"/>本发明还涉及用于合成如上所述的标记试剂的方法,其包括以下步骤(PyDKB型的分子):xa0a)使芳族羧酸衍生物与内酯的烯醇化物进行反应(Claisen型反应)以形成环状前体,xa0b)然后用卤代酸使所述环状前体开环以形成芳族卤代酮,xa0c)通过保护基保护所述芳族卤代酮的羰基官能团以形成受保护的前体,xa0d)使所述受保护的前体进行胺化反应(Gabriel型)以形成胺化了的前体,xa0e)将所述胺化了的前体脱保护以释放胺官能团,使所述胺官能团与其羧基官能团被活化的可检测标记物反应以形成包含可检测标记物的前体,xa0f)使经标记的前体进行所述羰基官能团的脱保护反应以形成经标记的且包含羰基的前体,并且最终xa0g)通过将所述羰基官能团转化为重氮官能团,将所述经标记的且包含羰基的前体转化为如上所述的标记试剂。xa0对于PyDB型分子的合成,步骤如下:xa0a)将芳族二羧酸酯化以形成二酯,xa0b)用衍生自单保护的胺化了的乙二醇的化合物区域选择性地取代所述二酯以形成羧基官能团和胺官能团受保护的前体,xa0c)然后将所述前体还原为醇并且氧化为醛,xa0d)将在步骤c)中合成的醛进行酸处理以便在将所述胺官能团脱保护时伴随地保护该官能团以得到胺化了的缩醛,xa0e)使所述胺化了的缩醛与其羧基官能团被活化的可检测标记物反应以形成包含可检测标记物的前体,xa0f)使经标记的前体进行所述羰基官能团的脱保护反应以形成经标记的且包含羰基的前体,并且最终xa0g)通过利用Bamfordxa0Stevens型反应将所述羰基官能团转化为重氮官能团,将所述经标记的且包含羰基的前体转化为如上所述的标记试剂。xa0本发明还涉及用于标记生物分子,特别是核酸的方法,其包括在基本为水性的缓冲液形式的均质溶液中使生物分子和试剂接触。xa0本发明还提供能够通过上述的标记生物分子的方法获得的经标记的分子。xa0本发明还涉及标记和断裂单链或双链核酸的方法,其包括以下步骤:xa0·将所述核酸断裂,xa0·通过选自所述试剂的标记试剂将标记物结合在至少一个片段上,该试剂共价地且主要地偶联在所述片段的至少一个磷酸上。例如,图1中显示了与所述磷酸结合的此类技术。xa0根据第一个实施方案修改,所述方法的特征在于在两个步骤中完成所述断裂和所述标记。xa0根据第二个实施方案修改,所述方法的特征在于在一个步骤中完成所述断裂和所述标记。xa0无论何种实施方案修改,所述方法的特征在于在基本为水性的均质溶液中完成所述标记。xa0无论何种实施方案修改,所述方法的特征在于通过酶、物理或化学途径完成所述断裂。xa0上述方法使本申请人能够主张能够通过这些方法获得的经标记的核酸。xa0本发明还涉及用于检测目标核酸的包含上述经标记的核酸的试剂盒。xa0本发明还涉及固体载体,其上结合了上述试剂。xa0最后,本发明涉及用于捕获核酸的方法,其包括以下步骤:xa0·使用其上直接或间接地结合了至少一种上述生物分子、或上述核酸的固体载体,所述生物分子或所述核酸包含重氮甲基官能团,xa0·将其与能够包含游离核酸的生物样品接触,并且xa0·洗涤其中所述分子与至少一个核酸共价连接的固体载体。xa0这些第四代DKB分子具有被称为“连接基”的间隔臂L,和可由可检测基团(如生物素、半抗原、荧光体、荧光基团、发光基团等)构成的标记物R₁。xa0L是包含具有至少两个共价键的直链并且n是等于1的整数的连接臂。有利地是,无论所述试剂的何种前述实施方案或修改,L包含重复1-20次、优选1-12次并且更优选2-6次的-(O-CH₂-CH₂)-基团。xa0随附的实施例和附图表示特定的实施方案,并且不可将其视为对本发明的范围进行限制。xa0附图说明图1的反应路线图显示利用本发明的分子标记RNA或DNA形式的单链核酸。xa0图2是对本专利申请中所使用分子的概述。xa0图3是合成PyDB分子(分子10)的方法的反应路线图。xa0图4是合成PyDKB分子(分子19)的方法的反应路线图。xa0图5显示在液体介质中,PyDB和PyDKB分子相对于专利申请WO-A-02/090319所述的第二代[Bio-EG3]2-PDAM(以下简称BBP)分子的稳定性。xa0图6显示以干燥形式时,PyDB和PyDKB分子相对于第二代BBP分子的稳定性。xa0图7显示利用浓度各为45mM的标记物BBP和PyDB标记RNA扩增子在纯化后的结果。xa0图8显示利用浓度各为2mM的标记物BBP和PyDB并且在3mMxa0HCl存在下标记RNA扩增子在未经纯化的条件下的结果。xa0图9显示使用浓度为2.5mM的标记物PyDB或BBP标记的RNA扩增子经过24小时杂交后的标记稳定性。xa0图10显示根据所使用的标记技术,Kreatech(阿姆斯特丹,荷兰)的ULS(Universalxa0Labellingxa0System)或根据本发明,标记RNA扩增子的功效对比。xa0图11显示通过HPLC测定的两种第三代分子(间硝基DKB和对硝基DKB)相对于两种第四代分子(PyDB和PyDKB)在水性介质中溶解性的对xa0比。xa0
具体实施方式
在附图和说明书中,术语“相对荧光”和“RFU”相同。xa0在以下给出的实施例中将使用以下的缩写:xa0·Ar:芳族的,xa0·s:单峰,xa0·bs:单峰宽峰,xa0·d:双重峰,xa0·dd:双双峰,xa0·t:三重峰,xa0·q:四重峰,xa0·qu:五重峰,xa0·m:丘状峰(massif),xa0·M:多重峰,xa0·HPLC:高效液相色谱,xa0·TLC:薄层色谱,xa0·NMR:核磁共振,xa0·Yld:收率,xa0·Eq:当量,xa0·Rf或TR:保留时间,xa0·DMSO-d6:氘代二甲亚砜,xa0·DMCF:二甲基环己基甲酸铵,xa0·CDCl₃:氘代氯仿,xa0·DMF:二甲基甲酰胺,xa0·DCM:二氯甲烷,xa0·MeOH:甲醇,xa0·ACN:乙腈,xa0·AcOEt:乙酸乙酯,xa0·MilliQ水:超纯水(Millipore,Molsheim,France),xa0·DMAC:二甲基氨基肉桂醛,xa0·Si60:硅胶60FLUKA(40-63μm),xa0·UV:紫外线。xa0分析和合成所述化合物(实施例1、2、3、4和9)的通用条件如下:xa0设备:HPLC条件(系统HPLCxa0WATERSxa0Alliancexa02795,二极管阵列检测器PDA996,软件Empower第2版,柱WATERSxa0XTerraxa0MSxa0C184.6xxa030mm,2.5μM),流速:30°C下1ml/分(260nm处检测)xa0HPLC碱性方法:洗脱液A:milliQ水xa0洗脱液B:ACNxa0洗脱液C:500mM氨水,pHxa012xa0即,在20分钟内由1%至64%乙腈(恒定5mM的pH=9氨水)的线性梯度:。xa0HPLC中性方法:洗脱液A:milliQ水xa0洗脱液C:ACNxa0洗脱液D:500mM甲酸铵溶液,pHxa07xa0即,在20分钟内在10mM甲酸胺溶液中由1%至64%C的线性梯度。xa0合成:对于经生物素化的产物,通过在254nm处的UV检测或通过DMAC在ALUGRAMntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="32"/>MACHEREY-NAGELxa0SILxa0G/UV₂₅₄xa04x8cm(Duren,德国)硅胶平板上进行薄层色谱分析。xa0通过硅胶60FLUKA(40-63μm)色谱纯化产物。通过“快速”色谱进行分离的条件(氩气压力下)严格按照Clarkxa0Still等人描述的条件(Clarkxa0Still,W.;xa0Kahn,M.;Mitra,A.J.Org.Chem.1978,43,2923-2925),即,5cm/分钟的流速加压至15cm的固定高度的硅胶上,柱直径取决于待纯化产物的量和Rf。xa0对于实施例1,在Brükerxa0200MHz波谱仪上记录NMR谱。以ppm给出相对于作为内标的溶剂峰的化学位移(δ)(CDCl₃:7.24ppm;DMSO-d6:2.49ppm;D₂O:4.80ppm,25°C)。用上述缩写描述谱:s、d、t、q、qu、m和M。以赫兹(Hz)表示偶合常数(J)。xa0对于实施例2,在常温下,在Brukerxa0ACxa0200或Brukerxa0DPXxa0300波谱仪上进行¹H和¹³Cxa0NMR谱。以ppm表示相对于四甲基硅烷的化学位移(δ),并相对CHCl₃(δ_H=7.27,δ_C=77.0)或DMSO(δ_H=2.52,δ_C=40.0)进行校正。以赫兹(Hz)表示偶合常数(J)。将信号形状简写如下:bs和dd。xa0质谱:使用LCQ-离子阱仪(Thermofinnigan,Sanxa0José,CA,USA)得到质谱图(SM),其通过电喷雾离子化方法,以阳离子模式(positivexa0mode),以2-10μL/分钟通过硅胶管进样。所使用的主要溶剂是DCM和MeOH。xa0实施例1:吡啶重氮生物素(PyDB)的合成:目的:xa0为了证明根据以下公开的反应路线合成包含在重氮甲基官能团α位上的吡啶环和在芳环上的识别基团的分子的可行性:xa0步骤:xa0→吡啶-2,4-二羧酸二甲酯(2)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="329"/>在500mL烧瓶中加入PCl₅(39g;0.186mol;3eq)和吡啶-2,4-二羧酸(11.5g;6.2×10^-2mol)。在室温下将混合物搅拌45分钟:其形成绿色液体。然后将其用二氯甲烷(80mL)稀释,然后小心地加入甲醇(20mL)。将混合物全部倒入包含60gxa0NaHCO₃的水H₂O(300mL)中,用二氯甲烷洗涤水相(4×50mL),并用1Mxa0Na₂CO₃洗涤有机相(2×50mL)。通过快速色谱纯化粗产xa0物(洗脱液:75∶25xa0AcOEt/环己烷)。xa0固体:m=11.71gxa0收率:96%xa0储存:室温xa0¹Hxa0NMR(200MHz,CDCl₃):4.03(s,3H,-OMe);4.09(s,3H,-OMe);8.07(dd,J=6Hz,1H,H₃);8.68(s,1H,H₅);8.91(d,J=4.6Hz,1H,H₂)。xa0¹³Cxa0NMR(75MHz,CDCl₃):53.28(C₈,C₁₀);124.49(C₅);126.29(C₃);138.64(C₄);149.06(C₆);150.92(C₂);162.45(C₇);164.96(C₉)。xa0→2-{N-[13-(叔丁氧羰基氨基)-4,7,10-三氧杂十三烷基]氨基羰基}吡啶-4-羧酸甲酯(3)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>在25mL烧瓶中加入在甲苯(3mL)中的二酯2(2.25g;1.1×10^-2mol)。加入Boc-二胺(3.7g;1.2×10^-2mol;1.1eq),然后在90°C下将混合物搅拌20小时。将甲苯蒸发,然后通过快速色谱纯化粗产物(洗脱液梯度:10%、20%和30%二氯甲烷/丙酮)。xa0透明油:m=2.9gxa0收率:55%xa0储存:室温xa0¹Hxa0NMR(300MHz,CDCl₃):1.42(s,9H,-Boc);1.74(q,2H,H₉);1.92(q,2H,H₁₆);3.21(q,2H,H₈);3.61(m,16H,H₁₀-H₁₁-H₁₂-H₁₃-H₁₄-H₁₅-H₁₇);3.97(s,3H,-OMe);5.01(m,1H,N-H);7.96(d,1H,H₅);8.35(s+d,2H,H₃+H₂);8.69(m,1H,N-H)。xa0¹³Cxa0NMR(75MHz,CDCl₃):28.63(C₂₀-C₂₁-C₂₂);29.30(C₁₆);29.74(C₉);37.55(C₁₇);38.85(C₈);53.02(C₂₄);69.69(C₁₀-C₁₅-C₁₁-C₁₄);70.78(C₁₂-C₁₃);79.97(C₁₉);121.60(C₅);125.52(C₃);139.08(C₄);149.23(C₂);151.76(C₆);156.27(C₁₈);163.65(C₇);165.60(C₂₃)。xa0→4-(羟甲基)吡啶-2-N-[13-(叔丁氧羰基氨基)-4,7,10-三氧杂十三烷基]xa0甲酰胺(4)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>在250mL烧瓶中将单酯(2.73g;5.4×10^-3mol)溶于MeOH。通过冰浴冷却混合物,并逐渐加入NaBH₄(1.32g;3.5×10^-2mol;6.5eq)。在室温下搅拌混合物30分钟。xa0在H₂O(100mL)中稀释混合物,并用饱和NH₄Cl中和,然后用二氯甲烷萃取(4×100mL)。将有机相合并、蒸发,并在干燥器中真空干燥一夜。xa0透明油:m=2.44gxa0收率:95%xa0储存:室温xa0¹Hxa0NMR(200MHz,CDCl₃):1.42(s,9H,-Boc);1.75(q,2H,H₉);1.91(q,2H,H₁₆);3.02(m,1H,OH);3.19(q,2H,H₈);3.59(m,16H,H₁₀-H₁₁-H₁₂-H₁₃-H₁₄-H₁₅-H₁₇);4.79(d,2H,H₂₃);5.03(m,1H,N-H);7.47(d,1H,H₃);8.15(s,1H,H₅);8.39(m,1H,N-H);8.51(d,J=5Hz,1H,H₂)。xa0¹³Cxa0NMR(75MHz,CDCl₃):28.77(C₂₀-C₂₁-C₂₂);29.26(C₁₆);30.07(C₉);37.68(C₁₇);39.01(C₈);63.70(C₂₃);69.42(C₁₀-C₁₅);70.39(C₁₁-C₁₄-C₁₂-C₁₃);79.96(C₁₉);119.95(C₅);123.87(C₃);148.44(C₂);150.03(C₆);143.34(C₄);156.42(C₁₈);164.96(C₇)。xa0→4-(甲酰基)吡啶-2-N-[13-(叔丁氧羰基氨基)-4,7,10-三氧杂十三烷基]甲酰胺(5)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>在氩气下,在-70°C下向DMSO(2.0mL,28.2mmol)的二氯甲烷(8mL)溶液中加入溶于二氯甲烷(5mL)中的(COCl)₂(1.2mL,13.7mmol)。将其在-70°C在搅拌下放置30分钟,然后将溶于二氯甲烷(20mL)的醇4(1.92g,4.2xa0mmol)逐滴加入。将其在-70°C温度在搅拌下放置30分钟,然后加入NEt₃(6.5mL,47mmol)。在0°C下将反应混合物搅拌3hr,然后将其倒入水(70mL)中。用所述二氯甲烷萃取水相,洗涤(NaHCO₃),用MgSO₄干燥并蒸发得到粘稠的油。然后发生Me₂S的释放,因此必须使用次氯酸钠溶液以将其捕获和洗涤污染的容器。通过快速色谱纯化粗产物(洗脱液:85∶15xa0AcOEt/丙酮)。xa0透明油:xa0m=1.46gxa0收率:75%xa0¹Hxa0NMR(300MHz,CDCl₃):1.42(s,9H,-Boc);1.76(q,J=6Hz,2H,H₉);1.95(q,J=6Hz,2H,H₁₆);3.22(q,2H,H₈);3.57(m,16H,H₁₀-H₁₁-H₁₂-H₁₃-H₁₄-H₁₅-H₁₇);4.98(m,1H,N-H);7.85(d,1H,H₃);8.59(s,1H,H₅);8.77(d,1H,H₂);10.15(s,1H,H_a1)。xa0¹³Cxa0NMR(75MHz,CDCl₃):29.59(C₂₀-C₂₁-C₂₂);30.03(C₉-C₁₆);38.11(C₈-C₁₇);70.11(C₁₀-C₁₅);70.99(C₁₁-C₁₄-C₁₂-C₁₃);79.50(C₁₉);122.27(C₅);123.68(C₃);143.22(C₄);149.80(C₂);152.61(C₆);156.35(C₁₈);163.62(C₇);191.32(C₂₃)。xa0→4-(二甲氧基甲基)吡啶-2-N-(13-氨基-4,7,10-三氧杂十三烷基)甲酰胺(6)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>将醛5(1.4g,3.1mmol,1eq)溶于10mL甲醇中。加入TMSCl(1mL,7.9mmol,2.5eq),并将混合物搅拌过夜。加入1M氢氧化钠溶液(40mL),并用二氯甲烷萃取产物,在碳酸钠的存在下干燥有机相,并真空蒸发溶剂。xa0M=997mgxa0收率:81%xa0¹Hxa0NMR(300MHz,CDCl₃):8.54(d,1H,H₆),8.35(brxa0s,1H,H₈),8.24(s,xa01H,H₃),7.52(d,1H,H₅),5.42(s,1H,H₂₃),3.71-3.53(m,15H,H₉+H_11-16),3.33(s,6H,H_24,25),2.80(t,2H,H₁₈),1.91(五重峰,2H,H₁₀),1.75(五重峰,2H,H₁₇)。xa0→缩醛-生物素(7)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>将缩醛(6)(1.54g,3.9mmol)溶于30mL二氯甲烷中。加入生物素(1.36g,4.2mmol,1.1eq)并将混合物搅拌2小时。用50mLxa01M碳酸钠将溶液萃取3次。用50mL二氯甲烷洗涤水相。用硫酸镁干燥有机相,并将溶剂蒸发。通过快速色谱纯化粗产物:SiO₂,Φ=50mm,15cm。洗脱液:700mLxa010%甲醇/二氯甲烷,然后1Lxa015%甲醇/二氯甲烷。然后将溶剂蒸发,并且用乙醚洗涤油性残余物。得到白色粉末。xa0m=1.78gxa0收率:74%xa0¹Hxa0NMR(300MHz双,CDCl₃):8.55(d,1H,H₂),8.35(t,1H,H₁₃),8.26(s,1H,H₅),7.55-7.53(m,1H,H₁),6.7(宽s,1H,H₄₂),6.2宽s,1H,H₄₀),5.44(s,1H,H₇),4.4-4.6(m,1H,H₃₈),4.2-4.4(m,1H,H₃₉),3.71-3.54(m,16H,H₁₅,H_17-25,H₂₇),3.34(s,6H,H_10-11),3.2-3.1(m,1H,H₃₅),3-2.8(m,1H,H₃₇),3.8-3.7(m,1H,H_37’),2.19(t,2H,H₃₁),1.92(五重峰,2H,H₁₆),1.8-1.3(m,8H,H₂₆,H_32-34)。xa0→醛(8)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>将缩醛(7)(1.76g,2.8mmol)溶于80∶20乙酸/水溶液(20mL)中,并在氩气下,在60°C下将混合物搅拌24小时。将溶液蒸发,并用乙醚洗涤油性残余物直至得到白色粉末。xa0M=1.83gxa0收率:约100%xa0¹Hxa0NMR(300MHz双,DMSO-d6):10.17(s,1H,H₈),8.92(s+d,2H,H_10,2),8.42(s,1H,H₅),7.99(d,1H,H₁),7.73(t,1H,H₂₅),6.4-6.3(s+宽s,2H,H_39,37),4.3-4.1(m+m,2H,H_35,36),3.53-3.28(m,18H,H_12,14-22,24),3.07(m,1H,H₃₂),2.80(d,1H,H₃₄),2.78(d,1H,H_34’),2.2-1.00(m,12H,H_13,28-31)。xa0→甲苯磺酰腙(9)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>在氩气下,在130°C下将在二甲基甲酰胺(20mL)中的醛8(1.62g,2.79mmol)的溶液搅拌30分钟。加入4-甲基苯磺酰肼,并且将混合物搅拌1小时。将溶剂蒸发,并且通过快速色谱纯化粗产物:SiO₂,Φ=30mm,15cm,洗脱液:10%甲醇/二氯甲烷。用乙醚洗涤油性残余物直至得到黄色粉末。xa0M=1.57gxa0收率:75%xa0¹Hxa0NMR(300MHz双,DMSO-d6):12.0(宽s,1H,H₃₉),8.83(s,1H,H₈),8.63(d,1H,H₂),8.13(s,1H,H₄₁),7.99(s,1H,H₅),7.77(d,2H,H_46,50),7.69(d,xa01H,H₁),7.42(d,2H,H_47,49),6.41(s,1H,H₃₇),6.35(s,1H,H₃₅),4.4-4.2(m,1H,H₃₄),4.0-4.2(m,1H,H₃₃),3.51-3.33(m,16H,H_9,11-20,22),3.1-3.0(m,2H,H₃₂),2.8-2.7(m,1H,H₃₀),2.36(s,3H,H₅₁),2.03(t,2H,H₁₀),1.77(t,2H,H₂₁),1.6-1.2(m,8H,H_26-29)。xa0→最终的重氮化合物(10)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>在25mL烧瓶中加入甲苯磺酰腙9(200mg,0.27mmol)。加入在甲醇(10mL)中的氢化钠(60%,在油中)(42.8mg,1.07mmol,4eq)溶液,并在室温下将混合物搅拌24小时。用10mLxa00.5M的Na₂CO₃和4×10mL二氯甲烷萃取产物。用乙醚洗涤油性残余物。得到橙色粉末。xa0M=135gxa0收率:88%xa0¹Hxa0NMR(200MHz双,CDCl₃):8.31-8.28(brxa0s+d,2H,H_8,2),7.73(d,1H,H₅),6.88(dd,1H,H₁),6.62(t,1H,H₂₃),6.13(s,1H,H₃₇),5.32(s,1H,H₃₅),5.10(s,1H,H₃₉),4.6-4.4(m,1H,H₃₄),4.4-4.2(m,1H,H₃₃),3.7-3.5(m,18H,H_9,11-20,22),3.13(m,1H,H₃₀),2.88(dd,1H,H₃₂),2.72(d,1H,H_32’),2.2-1.3(m,12H,H_10,21,26-29)。xa0结果和结论:xa0我们证实了以良好的收率合成包含与具有识别基团(生物素)的吡啶环缀合的重氮甲基官能团的化合物是可行的。xa0实施例2:吡啶重氮酮生物素(PyDKB)的合成目的:xa0为了证实根据以下的反应路线合成包含在重氮官能团α位上的吡啶环xa0和在所述重氮官能团α’位上的识别基团(生物素)的分子的可行性。xa0步骤:xa0→溴代酮(12)的合成xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="433"/>将γ-丁内酯(5.020g/4.55ml;32.23mmol;1.0eq)稀释于THF(15ml;3.3v)中,然后在冰浴中冷却至0°C。在5分钟内分批地加入氢化钠(60%;3.018g;75.42mmol;2.27eq),然后移去冰浴30分钟。将烧瓶回复至0°C,然后逐滴加入溶于THF(245ml;64.5v)中的异烟酸乙酯(3.80ml;49.84mmol;1.5eq)。在室温下搅拌反应18小时。通过真空蒸发去除THF,然后将残余物溶于100ml乙醚中,使所期待的产物沉淀,并且将悬浮液过滤,然后在1mbar下在旋转蒸发器上干燥20分钟以得到产物。将一些产物(4.721g;24.7mmol)溶于在水中的48%氢溴酸(38ml,即650mM)中,然后升温至110°C保持2小时。用Na₂CO₃将反应混合物碱化至pHxa09,然后用水加至200ml,并用200ml乙酸乙酯萃取两次。用Na₂SO₄干燥有机相,通过棉花过滤,并且在旋转蒸发器上蒸发。xa0m=3.096gxa0收率(经过两个步骤):21%xa0HPLC方法:中性xa0→受保护的溴代酮(13)的合成xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="433"/>在500mL烧瓶中,将溴代酮(3.096g;13.57mmol;1.0eq)溶于加入了三甲基氯硅烷(51.5ml;407.2mmol;30.0eq)的无水甲醇(165ml;80mM),然后将反应混合物置于氩气下,随后加热至53°C(低于所述试剂沸点的温度)保持18小时。将反应混合物蒸发至干,然后将其溶于50ml水中并用35%苛性钠溶液碱化至pHxa09-10,然后加至200ml,并用2xxa0150mL二氯甲烷(亦xa0缩写为DCM)萃取。用Na₂SO₄干燥有机相,过滤并减压蒸发至干。将蒸发残余物溶于1mLxa0DCM中,并加载到正相Si60硅胶柱(h=5cm;直径=15cm;洗脱液:DCM/MeOH:95/5)上。xa0m=1.506gxa0收率:40%xa0TLC洗脱液:DCM/MeOH:95/5xa0HPLC方法:中性xa0¹Hxa0NMR(200MHz,CDCl3):δ=1.4-1.7(M;2H;e);3.0-3.25(m;8H;f,g);3.30(t;2H;d);7.42(d;2H;a);8.65(d;2H;b)。xa0→受保护的胺化了的酮(Gabriel反应)(15)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="501"/>在100mL烧瓶中加入溴代酮(1.506g;5.49mmol;1.0eq)、邻苯二甲酰亚胺钾(1.526g;8.24mmol;1.5eq)和DMF(55mlxa00.1M),然后在155°C下加热15分钟。将溶剂蒸发至干,然后将蒸发残余物溶于200mlxa0100mM苛性钠溶液中,并用2xxa0200mLxa0DCM萃取,然后用Na₂SO₄干燥二氯甲烷相,过滤并蒸发至干以得到化合物14。将其全部(5.49mmol;1.0eq)与在水(21.35ml;109.8mmol;20eq)和甲醇(109ml;50mM)中的25%肼反应,并且将反应混合物搅拌18小时。将溶剂去除,然后将残余物溶于200mlxa010mM的苛性钠溶液中,然后用3xxa0200mLxa0DCM萃取。用Na₂SO₄干燥有机相,过滤并减压蒸发,然后将所得的油溶于1mLxa0DCM,并加载到正相Si60硅胶柱(h=15cm;直径=3cm;洗脱液:DCM/MeOH/NH₃:97.5/2.5/1)上。xa0m=300mgxa0收率:26%xa0TLC洗脱液:DCM/MeOH/NH₃:90/10/1xa0HPLC方法:中性xa0¹Hxa0NMR(邻苯二甲酰亚胺14)(200MHz,CDCl3):δ=1.2-1.3(M;2H;e);1.88(M;2H;d);3.03(t;6H;g);3.44(dd;2H;f);7.45(d;2H;a);7.57-7.71(m;4H;i和j);8.52(d;2H;b)。xa0¹Hxa0NMR(胺15)(200MHz,CDCl3):δ=1.0-1.2(m;4H;e和f);1.88(M;2H;d);2.54(t;2H;h);3.15(t;6H;g);7.35(d;2H;a);8.58(d;2H;b)。xa0→被活化的生物素的合成(20)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="672"/>将生物素(5g;23.1mmol;1.0eq)悬浮于无水DMF(50ml)和吡啶(2.07ml;25.4mmol;1.1eq)中。在搅拌5分钟后,加入三氟乙酸五氟苯酯(PFP-TFA:4.621ml,即7.50g;25.4mmol;1.1eq)。在搅拌一夜后,结束反应并在旋转蒸发器上蒸发溶剂。将蒸发残余物溶于100ml乙醚中以使其悬浮,然后通过多孔过滤器过滤,并将滤饼用最少量的乙醚清洗。注意:在TLC中可观察到少量的生物素,但这不会对后续的产生影响。xa0m=7.106gxa0收率:81%xa0TLC洗脱液:DCM/MeOH:90/10。xa0→生物素和芳胺之间的偶联(化合物16)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>在60°C下将化合物15(808mg;2.0mmol;1.4eq)溶于DMF(4.28ml)中,然后在搅拌5分钟后加入三乙胺(1.60ml;11.4mmol;8.0eq)。一次性全部加入溶于DMF(2.85ml,500mM,即300mg;1.4mmol;1.0eq)的化合物20。60分钟后减压蒸发溶剂。不进行其它处理,并将粗反应产物直接用于脱保护。xa0质量和收率将在其后的步骤中计算。xa0HPLC方法:中性xa0→生物素化的酮(化合物17)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>将化合物16溶于50mlxa06M的盐酸溶液中,并在室温下搅拌2小时。将溶液蒸发至干;残余物是盐酸盐形式的红色油。将其溶于90/8/2的DCM/MeOH/TEA混合液中,所述油脱色并且释放出气体,加入2mL三乙胺,然后将混合物蒸发至干以得到沉淀物,将沉淀物溶于100ml乙醚和10mLxa0DCM中,将悬浮液过滤,并用50ml乙醚研制滤饼,然后将其放于28°C的真空烘箱中2小时。将粉末溶于5mL加入了250μlxa02M苛性钠溶液的88/12xa0DCM/MeOH混合物中以将其全部溶解。将该溶液加载到Si60硅胶柱,柱直径=3cm,h=16cm,v=5cm/分钟,用88/12xa0DCM/MeOH混合物洗脱。xa0m=940mgxa0经过两个步骤,并且如果不考虑2.9eq盐酸三乙胺的话,收率为:83%。xa0TLC洗脱液:DCM/MeOH:85/15。xa0HPLC方法:中性。xa0¹Hxa0NMR(200MHz,DMSO):δ=1.28(t;TEA);1.49(M;2H;k);1.30-1.50(m;4H;j和l);1.73(五重峰;2H;e);2.05(t;2H;i);2.6-2.8(M;2H;m);2.9-3.2(m;TEA的5H+H;d,f,n和TEA);4.0-4.3(m;2H;o和o’);6.38(s;1H;p’);6.43(s;1H;p);7.78(d;2H;b);7.95(t;1H;h);8.08(d;2H;a);10.3(M;TEA盐酸盐)。xa0→酮的腙化(18)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>将酮17(400mg;506.5μmol)溶于DMF(2.25ml;224mM)、MeOH(11.3xa0ml;44.8mM)和乙酸(580μl;10.13mmol;20eq)中,然后加入247μl水合肼(246μL;5.065mmol;10eq)。将溶液搅拌2小时,然后蒸发至干。xa0将蒸发残余物溶于5ml水中,然后转移至15ml烧瓶中,然后用2M苛性钠碱化至pH到达10,产物沉淀,并且通过涡旋搅拌试管以良好地混合,然后在8000rpm下离心。弃去上清液,然后用5mlxa0pHxa010的苛性钠溶液再重复该操作两次。室温下在真空烘箱中干燥沉淀物(黄色粉末),然后将其用于氧化步骤。xa0m=190mgxa0收率:93%xa0HPLC方法:先中性后碱性xa0¹Hxa0NMR(200MHz,DMSO):δ=1.2-1.7(m;8H;e,j,k和l);1.73(五重峰;2H;e);2.06(t;2H;i);2.6-2.9(M;2H;m);3.0-3.2(m;3H;f和n);4.10-4.35(m;2H;o和o’);6.39(s;1H;p’);6.47(s;1H;p);7.11(s;2H;r);7.55(d;2H;b);7.87(t;1H;h);8.47(d;2H;b)。xa0→生物素化的吡啶重氮酮(PyDKB)(19)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>将腙18(177.2mg;438μmol;1.0eq)部分溶于DMF(22ml;20mM),然后冷却至0°C以加入四甲基胍(448μl;3.56mmol;8.14eq)、xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="71"/>分子筛(722mg;所用试剂质量的3.8倍)和氧化锰(2.387g;35.6mmol;81.4eq)。将悬浮液搅拌20分钟,然后用1cm厚的硅藻土短柱过滤,并用甲醇清洗短柱直至滤液变为无色。将溶液蒸发至干,然后溶于20mLxa090/10xa0DCM/MeOH中,并用0.25Mxa0Na₂CO₃溶液洗涤。形成沉淀物。经分析后,将沉淀物和有机相合并并蒸发至干,以使其溶于100mLxa090/10xa0DCM/MeOH混合物中,并用100mLxa00.05Mxa0Na₂CO₃洗涤。将有机相回收,用无水Na₂CO₃干燥,过滤并蒸发至干。xa0m=42.8mgxa0收率:24.3%xa0HPLC方法:碱性xa0¹Hxa0NMR(200MHz,DMSO):δ=1.20-1.74(m;8H;e,j,k和l);1.73(五重峰;2H;e);2.07(t;2H;i);2.6-2.9(M;2H;m);3.00-3.25(m;3H;f和n);4.10-4.35(m;2H;o和o’);6.37(s;1H;p’);6.44(s;1H;p);6.94(d;2H;b);7.90(t;1H;h);8.35(d;2H;b).xa0结果和结论:xa0我们证实了以良好的收率合成包含在α位与吡啶环缀合并且在α’位与识别基团(生物素)结合的重氮甲基官能团的化合物是可行的。xa0实施例3:证明室温下在液体介质中PyDB或PyDKB相对于与BBP(双-bio-PDAM)分子的稳定性目的:xa0目的是为了证明PyDB或PyDKB分子相对于第二代分子在液体介质中的稳定性。为此,在极端条件下进行了加速稳定性研究,其中在室温(22°C+/-1°C)下将125mM的化合物储存于96/4xa0DMSO/甲醇混合物中。应注意这是极端的储存条件。xa0方法:xa0将图2中所示的这三种化合物PyDB、PyDKB和BBP以125mM溶于96/4DMSO/甲醇混合物中,并且储存于常温下(22°C+/-1°C)。然后将2μL这些溶液常规进样至HPLC(碱性方法,Watersxa0HPLC系统),以通过色谱图(软件Empowerxa02上的PDAMaxxa0Plot)中全部峰的积分测定主要产物的降解。然后将初始化合物的纯度差异作为时间的函数作图,如图5所示。xa0结果和结论:xa0清楚地证明了BBP在几天内降解(在第10天纯度<10%),而在该时间段末,两种第四代分子PyDB和PyDKB至少稳定在大于80%。xa0吡啶基部分在重氮官能团α位上的存在通过使该重氮官能团对水解更不敏感的电子非定域化使后者稳定。标记物在α’位上的存在通过使该官能团更不易于在水性介质中水解进一步显著地稳定该官能团。xa0实施例4:证明在+4°C下以干燥形式时PyDB相对于BBP分子的稳定性目的:xa0为了证明PyDB或PyDKB分子相对于第二代BBP分子的干燥稳定性。xa0方法:xa0将两种PyDB化合物和BBP以250mM溶于pHxa07.5的10mMxa0Trisxa0HCl和10%海藻糖中。将溶液以50nmol的等分部分冷冻干燥一夜。然后将干燥产物在+4°C下储存。将这些等分部分常规地溶于甲醇中,并将15μL这些溶液进样至HPLC(Waters)以通过色谱图(软件Empower的PDAxa0Maxxa0Plot)中全部峰的积分来测定主要产物的降解。然后将初始化合物的纯度差异作为时间的函数作图,如图6所示。xa0结果和结论:xa0以与实施例3中相同的方法,但更明显地证明了BBP不能经受冷冻干燥(该步骤降解>60%),而在该操作中,PyDB和PyDKB极佳地保持稳定。此外,以干燥状态且在4°C下存放大于1个月显示仅有非常少的降解(两种第四代标记物的纯度大于80%)。xa0再次证明了吡啶基部分在重氮官能团α位上的存在通过使该重氮官能团对水解更不敏感的电子非定域化使后者稳定。xa0实施例5:在中间纯化的条件下,使用PyDB和BBP分子标记核酸的对比目的:xa0为了证明与第二代分子(BBP)相比使用PyDB分子对核酸进行标记的功效。xa0为此,通过与重氮标记物反应,将得自扩增反应(NASBA,NucliSensxa0Basicxa0Kit试剂盒,来自bioMérieuxxa0B.V.-Boxtel-荷兰)的RNA扩增子——174个碱基的结核分枝杆菌(Mycobacteriumxa0tuberculosis)序列片段用生物素标记。通过在购自Affymetrix(J.Clin.Microbiol.,37(1),PP49-55,A.Troesch等人,1999中所描述的Customxa0DNAxa0Chipxa0Comboxa0Myco)的DNA芯片上进行杂交来检测所述标记反应的产物。xa0方法:xa0在试管中,将以下的混合:xa0·18μLxa0250mM标记物溶液(96/4xa0DMSO/甲醇),所述标记物是PyDB或BBP,xa0·12μLxa0DMSO,xa0·15μLxa0NASBAxa00.5X缓冲液(“NucliSensxa0Basicxa0Kitxa0Easyxa0Qxa0bioMérieux”试剂盒),xa0·35μLxa01Mxa0Trisxa0HCl,xa0·5μLxa00.1Xxa0NASBA(稀释10倍的NASBA酶扩增反应,174个碱基的扩增子),和xa0·15μLxa020mMxa0HCl。xa0通过涡旋将溶液混合,然后在65°C下温育10分钟。xa0核酸的纯化:使用生产商推荐的纯化规程,在QiaQuick柱(PCR纯化试剂盒QiaQuick,Qiagen,Hilden,德国)上纯化经标记的核酸。洗脱体积为100μL。xa0DNA芯片上的杂交反应:纯化后,将经标记的核酸转移至400μL杂交缓冲液中。在为分析结核分枝杆菌的16Sxa0RNA的“GenBank”M20940序列而设计的DNA芯片上使样品杂交。在A.Troesch等人发表于J.Clin.Microbiol.,37(1),PP49-55,1999的文章中描述了该DNA芯片。xa0使用前述A.Troesch等人的文章中描述的杂交规程和缓冲液在FSxa0450洗涤工作站中进行杂交步骤。xa0通过与用藻红蛋白(PE)标记的链霉亲和素(SA)偶联来显示杂交,所述链霉亲和素按以下条件与所使用的标记物的生物素进行相互作用:xa0300μL纯水;300μLxa0100mMxa0Tris缓冲液pHxa07/1xa0Mxa0NaCl/0.05%吐温20/0.005%消泡剂;6μLxa0BSA(50mg/mL);6μLxa0SA-PE(300μg/mL)。xa0读取DNA芯片:使用Affymetrix供应的读取系统和软件(Scannerxa0Genexa0Chipxa0Array和GCOS软件)读取标记和杂交后DNA芯片表面上发射的荧光,并生成关于信号强度和百分比同源性的数据。所述读取系统提供以rfu(“相对荧光单xa0位”)表示的信号和背景噪声强度。百分比同源性(图7和随后的图8和图10中的%BC或%正确(%right))是相对于参照序列(在本案中为结核分枝杆菌的序列)给出的。xa0在关于标记物BBP和PyDB的图7的图中给出关于中值信号强度(Med)、中值背景噪声(Medxa0Bckgd)和百分比同源性(%正确)的结果。xa0通常,大于90%的百分比同源性被视为优选。此外,期待高特异性的信号和低背景噪声。xa0结果和结论:xa0该实施例表明,标记物PyDB给出的荧光信号是BBP参照分子所给出的信号的三倍。xa0考虑到PyDB非常良好的稳定性,该标记物证明了其比前代分子的优势。xa0实施例6:在无中间纯化的条件下,使用PyDB和BBP分子标记核酸的对比目的:xa0目的是为了证明与实施例5相同的内容,但是使用了不利的条件,其中过量的标记物没有通过纯化去除。xa0方法:xa0在1mL的试管中,将以下的混合:xa0·5μLxa08mM标记物溶液(96/4xa0DMSO/甲醇)。所述标记物是PyDB或BBP,xa0·5μLxa00.1Xxa0NASBA(来自bioMérieux的NucliSensxa0Basicxa0Kit试剂盒),xa0·5μLxa01Mxa0Trisxa0HCl,和xa0·15μLxa020mMxa0HCl。xa0将溶液通过涡旋混合,然后在65°C下温育10分钟。如此标记的核酸未经纯化而直接杂交。xa0在DNA芯片上杂交:将经标记的核酸不经纯化转移至480μL杂交缓冲溶液中。以与之前实施例相同的方法在DNA芯片上使样品杂交。xa0读取DNA芯片:在图8的图中显示了标记物BBP和PyDB关于强度、背景噪声和百分比同源性的结果。xa0结果和结论:xa0该实施例表明,标记物PyDB因其结构显示出比参照分子BBP更低的背景噪声。表明特异性杂交的特异性信号也得以提高,并且相对于BBP较低的百分比同源性,PyDB(2mM)的百分比同源性更高。xa0再次证明了第四代分子比前代分子的优势。xa0实施例7:评价用PyDB标记的扩增子经过24小时的稳定性目的:xa0目的是为了证明经标记的RNA扩增子可在DNA芯片上杂交达24小时而不失去其荧光强度,这证明了RNA-标记物键的稳定性。xa0方法:xa0在试管中,将以下的混合:xa0·5μLxa010mM在DMSO/MeOH(96/4)中的标记物(PyDB或BBP)溶液,xa0·5μLxa0NASBAxa00.1X(来自bioMérieux的NucliSensxa0Basicxa0Kit试剂盒)扩增产物,xa0·5μLxa01Mxa0Trisxa0HCl,和xa0·5μL水。xa0将溶液通过涡旋混合,然后在65°C下温育10分钟。xa0核酸的纯化:使用生产商推荐的纯化规程在QiaQuick柱(PCR纯化试剂盒Qiagen)上纯化经标记的核酸。洗脱体积为100μL。xa0在DNA芯片上杂交:纯化后,将经标记的核酸转移至400μL杂交缓冲液中。在为分析结核分枝杆菌的16Sxa0RNA的“GenBank”M20940序列而设计的DNA芯片上使样品杂交。在A.Troesch等人发表于J.Clin.Microbiol.,37(1),PP49-55,1999的文章中描述了该DNA芯片。xa0通过将80μL杂交混合物进样至芯片中,然后将其在杂交烘箱中于xa045°C维持0.5小时、2小时、6.5小时或24小时来进行杂交步骤。xa0通过与用藻红蛋白(PE)标记的链霉亲和素(SA)偶联来显示杂交,所述链霉亲和素按以下条件与所使用的标记物的生物素进行相互作用:xa0300μL纯水;300μLxa0100mMxa0Tris缓冲液pHxa07/1Mxa0NaCl/0.05%吐温20/0.005%消泡剂;6μLxa0BSA(50mg/mL);6μLxa0SA-PE(300μg/mL)。xa0读取DNA芯片:使用Affymetrix供应的读取系统和软件读取标记和杂交后DNA芯片表面上发射的荧光,并生成关于信号强度和百分比同源性的数据。所述读取系统提供以rfu(“相对荧光单位”)表示的信号和背景噪声强度。百分比同源性是相对于参照序列(在该情况中为结核分枝杆菌的序列)给出的。xa0在关于第四代标记物PyDB的图9中给出中值信号强度(Med)随着杂交持续时间的结果。xa0表明随着杂交持续时间,荧光信号保持稳定或甚至具有增大的趋势。xa0结果和结论:xa0该实施例表明,在可延长24小时的杂交过程(对于癌学中基因的长时间杂交和表达是特别有益的)中,用PyDB标记的扩增子极佳地保持稳定,参见图9。xa0甚至观察到在时间过程中荧光信号的增大,这是由于扩增子更好的杂交(杂交动力学缓慢)。xa0由此证明了标记物-核酸键的稳定性。xa0实施例8:本发明中所描述的分子与商购技术(ULSxa0RNAxa0Labellingxa0Kit)的标记功效对比:方法:xa0与之前相同通过NASBA扩增制备RNA扩增子,用BBP和PyDB分子标记该RNA扩增子。xa0在试管中,将以下的混合:xa0·5μLxa01Xxa0NASBA(来自bioMérieux的NucliSensxa0Basicxa0Kit试剂盒),xa0·5μLxa020mM在96/4DMSO/MeOH中的标记物(PyDB或BBP)溶液,xa0·5μLxa01Mxa0Trisxa0HCl,pHxa07.4,和xa0·5μL水。xa0将溶液通过涡旋混合,然后在65°C下温育10分钟。xa0对于使用来自Kreatech(阿姆斯特丹,荷兰)的商购试剂盒“ULSxa0RNAxa0Labellingxa0Kit”进行的标记,按照供应商推荐的规程。简言之,将以下的混合:xa0·20μLxa01Xxa0NASBA(NucliSensxa0Basicxa0Kit试剂盒,bioMérieuxxa0B.V.,Boxtel,荷兰)。xa0·1μL标记物溶液,xa0·3μLxa010x缓冲液,和xa0·6μL水。xa0将溶液在85°C下温育30分钟。xa0核酸的纯化:使用生产商推荐的纯化规程,在QiaQuick(PCR纯化试剂盒,Qiagen)柱上纯化通过BBP或PyDB分子标记的核酸。洗脱体积为100μL。xa0对于通过商购试剂盒ULSxa0RNAxa0Labellingxa0Kit标记的核酸,使用Kreatech(阿姆斯特丹,荷兰)推荐和提供的纯化。最终体积为30μL,根据该公司推荐,向其中加入100μL封闭液。xa0在DNA芯片上杂交:纯化后,将经标记的核酸转移至400μL杂交缓冲液(BBP或PyDB)或370μLxa0Kreatech杂交缓冲液中。在为分析结核分枝杆菌的16Sxa0RNA的“GenBank”M20940序列而设计的DNA芯片上使所述核酸杂交。xa0在A.Troesch等人发表于J.Clin.Microbiol.,37(1),PP49-55,1999的文章中描述了该DNA芯片。使用这篇A.Troesch等人的文章中描述的杂交规程和缓冲液在洗涤工作站(Affymetrixxa0FSxa0450)上进行杂交步骤。xa0通过与用藻红蛋白(PE)标记的链霉亲和素(SA)偶联来显示杂交,所述链霉亲和素按以下条件与所使用的标记物的生物素进行相互作用:xa0300μL纯水;300μLxa0100mMxa0Tris缓冲液pHxa07/1xa0Mxa0NaCl/0.05%吐温20/0.005%消泡剂;6μLxa0BSA(50mg/mL);6μLxa0SA-PE(300μg/mL)。xa0读取DNA芯片:使用Affymetrix供应的读取系统和软件(Genexa0Chipxa0Array和GCOS软件)xa0读取标记和杂交后DNA芯片表面上发射的荧光,并生成关于信号强度和百分比同源性的数据。所述读取系统提供以rfu(“相对荧光单位”)表示的信号(中值)和背景噪声(MedBgd)强度的中值。百分比同源性(%正确)(亦称为“碱基相同百分比(basexa0callxa0percentage)”(%BC))是相对于参照序列(在本案中为结核分枝杆菌的序列)给出的。xa0在关于标记物BBP和PyDB以及竞争性试剂盒的图10中给出关于中值信号强度(Med)、中值背景噪声(MedBgd)和百分比同源性(%正确或%BC)的结果。xa0结果和结论:xa0发现使用在完全按照供应商描述的条件下施用的顺铂标记物的技术(ULSxa0RNAxa0Labellingxa0Kit)比本发明提供的技术方案的标记能力差得多,这是由于使用该商购试剂盒时,必须加入4倍于RNA浓度以得到清楚地脱离背景噪声的信号(竞争品4X,图10),但在所有情况下该信号仍然更弱,其比使用BBP分子进行的标记弱10倍,并且比使用PyDB分子进行的标记弱18倍。xa0在所有情况下,百分比相同性(%BC或%正确)保持相同。xa0因此,相比另一标记技术,在核苷间的键上进行标记能得到显著更好的检测灵敏度,而且这与何代分子无关。对于第四代,在该新实施例中再次显示了其优势。xa0实施例9:两种第三代重氮标记物(对硝基DKB和间硝基DKB)和两种第四代标记物(PyDB和PyDKB)的溶解性对比:目标:xa0希望证明在重氮标记试剂上存在的吡啶环提高了分子的溶解性。xa0方法:xa0测定标记物的摩尔Epsilon(ε)精确称取数毫克(5-15mg)标记物,并以100mM溶于DMSO中(全部溶解)。将该溶液在MeOH中稀释10倍,然后再在MeOH中稀释100倍(最终稀释1000倍)。检测该溶液的UV光谱以测定测量吸光度的λmax。该测量可计算各标记物的摩尔ε(比尔-兰伯特定律)。xa0测定标记物在水中的溶解度:精确称取数毫克(5-15mg)标记物,并以100mM溶于水中(部分溶解)。通过涡旋将其搅拌并离心。将上清液移出并将其在MeOH中稀释10倍或100倍。检测所述标记物的UV光谱以确保没有发生降解。在λmax下测定吸光度,并且用之前确定的摩尔ε值计算在上清液中标记物的浓度,即标记物在水中的溶解度(图11)。xa0结果和结论:xa0在图11中可以发现,PyDB在水中的溶解度是第三代分子对硝基DKB和间硝基DKB的6倍。该溶解度的增加仅仅是由于吡啶环的存在。PyDB的溶解度是第三代分子对硝基DKB和间硝基DKB的9倍。该溶解度的增加主要由二取代的吡啶环给予。xa0因此,我们证明了吡啶环对这些分子的最终溶解性的非常大的影响。xa0我们确认,吡啶环是已知为碱性的环,并且本领域技术人员可以预期对重氮甲基官能团的稳定作用,但相反地缺乏对核酸的反应性。实际上,重氮/磷酸反应的机理是基于质子交换。捕获质子的环(吡啶)的存在可抑制所述反应,但是现已观察到该现象仅在使用较强的碱如哌啶时出现。所述标记反应是在pHxa07的缓冲介质中进行的。xa0在标记物在α’位上的实施例中,由于空间位阻增大的问题,本领域技术人员可以预期与磷酸的反应性问题。再次说明,这些分子的效果是令人惊讶的。xa0此外,在磷酸的烷基化过程中产生的非对应异构体存在干扰杂交并因此干扰核酸检测的风险。这是可预见的,并且使本领域技术人员相信该类型的标记物的效力会较低。因此,创造该类型分子并得到如此好的标记效果是非显而易见的。xa0